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方法大揭秘！5小時(shí)內(nèi)搞定高純度AAV腺相關(guān)病毒純化

貝克曼庫(kù)爾特生命科學(xué) 2025-07-10 | 閱讀：135

腺相關(guān)病毒（AAV）是基因治療中強(qiáng)大的遞送載體[1]。然而，在AAV組裝過(guò)程中，其包裝核酸序列的效率較低，導(dǎo)致只有一小部分病毒顆粒攜帶目標(biāo)基因[2,3]。富集純化這些正確組裝的病毒顆粒是下游純化工作流程中的關(guān)鍵步驟，而金標(biāo)準(zhǔn)氯化銫（CsCl）密度梯度超速離心（DGUC）是最佳方法之一[4]。盡管使用CsCl-DGUC可輕松純化出純度大于95%的完整AAV顆粒，但線性梯度液在超速離心中的運(yùn)行時(shí)間通常長(zhǎng)達(dá)16小時(shí)或更久[5]，將總工藝時(shí)間延長(zhǎng)至2-3天，限制了CsCl-DGUC的純化通量。

為應(yīng)對(duì)這一耗時(shí)費(fèi)力的挑戰(zhàn)，我們開(kāi)發(fā)了基于OptiMATE密度梯度分液系統(tǒng)的自動(dòng)化解決方案。該設(shè)備可自動(dòng)將梯度液和大量樣品預(yù)先配置成線性梯度。鑒于形成線性梯度液的緩慢過(guò)程是制約DGUC運(yùn)行時(shí)間的關(guān)鍵限制因素，預(yù)配置的線性梯度液能大幅縮短離心分離時(shí)間。而預(yù)配置梯度液的運(yùn)行時(shí)間主要取決于樣品顆粒遷移及運(yùn)行條件所引起的梯度曲線輕微變化。此外，OptiMATE還能消除梯度液制備中的人為因素影響，提升純化過(guò)程的一致性、準(zhǔn)確性和易用性。

我們展示了在5個(gè)小時(shí)內(nèi)自動(dòng)化、高分辨率的純化完整AAV病毒顆粒的實(shí)驗(yàn)流程。同時(shí)，也與16小時(shí)的傳統(tǒng)方法進(jìn)行了關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）的對(duì)比。

方法

在本實(shí)驗(yàn)中，使用了AAV純化中常用的13.5 mL和39 mL Ultra-Clear材質(zhì)的快封管。

表1：自形成CsCl密度梯度 (手動(dòng)) 和預(yù)形成CsCl密度梯度 (OptiMATE密度梯度液制備儀) 的離心參數(shù)

血清型AAV9通過(guò)三重轉(zhuǎn)染在HEK-293細(xì)胞中表達(dá)后，裂解細(xì)胞并離心，經(jīng)親和層析初步富集所有衣殼種類，該粗純化材料作為實(shí)驗(yàn)的AAV樣品。使用OptiMATE氯化銫溶液制備自形成和預(yù)形成CsCl密度梯度液，以AAV樣品作為稀釋劑（圖1）。在13.5 mL離心管加入5×1013病毒基因組（vgs）的AAV，在39 mL離心管加入1×1014 vgs的AAV。盡管預(yù)形成和自形成密度梯度的制備方法不同，但需確保每管使用等量的AAV。

我們將預(yù)形成密度梯度的超速離心時(shí)間設(shè)為5小時(shí)，因?yàn)槲覀冾A(yù)期這會(huì)產(chǎn)生更清晰（擴(kuò)散更少）的條帶。實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。離心后，通過(guò)側(cè)面穿刺提取AAV完整衣殼條帶，回收材料用1×PBS+0.01% Poloxamer 188進(jìn)行緩沖液替換。使用Optima AUC在230 nm處的吸光度檢測(cè)回收樣品中完整衣殼的純度，以評(píng)估純化的質(zhì)量。

圖1：AAV純化方案比較：(a) 自動(dòng)配置預(yù)形成CsCl梯度液和 (b) 手動(dòng)配置自成型CsCl梯度。在離心運(yùn)行結(jié)束時(shí)AAV樣品被純化為可見(jiàn)條帶 (空衣殼-藍(lán)色；完整的衣殼（紅色），用注射器從管的側(cè)面刺穿并收集條帶

結(jié)果

自形成密度梯度離心管與預(yù)形成密度梯度離心管的條帶存在一點(diǎn)差異，尤其是部分包裝和完整衣殼條帶的擴(kuò)散度（即清晰度），以及這些條帶與空衣殼條帶的分離度。然而，空衣殼條帶與完整衣殼條帶的分離度仍足以通過(guò)肉眼觀察和注射器穿刺提取回收。（結(jié)果如圖2和表2所示）

圖2：自形成密度梯度超速離心20小時(shí)后與預(yù)形成密度梯度超速離心5小時(shí)后代表性AAV條帶圖像，13.5mL離心管（左）和39mL離心管（右）

通過(guò)AUC檢查回收樣品的純度（圖3）。使用AUC分析得到的c (s) 圖通過(guò)積分來(lái)確定純化中完整衣殼的百分比。

圖3：預(yù)形成密度梯度（紅色）和自形成密度梯度（黑色）完整衣殼餾分組分的AUC數(shù)據(jù)的C (S) 圖顯示：在13.5 mL離心管（左）和39 mL離心管（右）中均無(wú)明顯的空衣殼鋒

我們觀察到相近的完整衣殼純化效率（預(yù)形成和自形成密度梯度均>90%完整衣殼），預(yù)形成密度梯度可在顯著更短的5小時(shí)超速離心時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)等效的完整衣殼純度，保守節(jié)省75%的時(shí)間。后續(xù)若通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化預(yù)形成密度梯度，可改善空衣殼、部分包裝衣殼和完整衣殼的視覺(jué)分離度。

表2：離心后回收AAV純度分析。13.5 mL離心管的誤差值（n=3），39 mL離心管（n=1）

結(jié)論

離心時(shí)間是OptiMATE通過(guò)自動(dòng)配置線性梯度液解決的關(guān)鍵痛點(diǎn)之一。因?yàn)樘荻纫翰辉僖蕾囍亓π纬?，預(yù)形成梯度液可顯著縮短離心時(shí)間，實(shí)現(xiàn)更快且高效的材料純化。在本研究中，我們證明了使用OptiMAT可將2-3天的純化操作流程時(shí)間縮短至單日以內(nèi)，在更短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)等效的AAV純度回收，便于純化工藝的放大。此外，制備時(shí)間的減少最大限度地減少了人員的手動(dòng)操作時(shí)間，顯著降低了操作誤差并提高了整體效率。